细胞培养液无菌检测的准备阶段，如何设置阴性对照?

细胞培养液无菌检测的准备阶段，如何设置阴性对照?

细胞培养液无菌检测准备阶段的阴性对照，核心作用是排除检测过程中环境、耗材、试剂等外源性污染，避免假阳性结果。设置需遵循 “与样品同流程、替代物无菌、无额外干预” 原则，具体操作步骤、规范及判定标准如下：

1、阴性对照的核心定义与设置目的

阴性对照是用无菌替代物(如缓冲液、无菌水)替代细胞培养液，完全复刻样品的检测流程，验证检测环境、耗材(滤膜、培养瓶)、试剂(冲洗液、酒精)等是否存在污染。若阴性对照出现微生物生长，说明检测体系被污染，本次样品检测结果无效。

2、阴性对照设置的详细操作步骤

无菌替代物的选择与验证

优先选用pH 7.0 氯化钠 - 蛋白胨缓冲液(适配薄膜过滤法，可去除样品中可能的抑菌成分，与检测体系兼容性强);若为直接接种法，也可用无菌注射用水。

替代物需确保无菌：商业化产品需核对 CoA 报告(无菌合格);自制缓冲液需经 121℃高压灭菌 15 分钟，冷却后现用，使用前可做简易无菌验证(取少量接种培养基，培养 2 - 3 天无浑浊)。

替代物用量与样品取样量一致：薄膜过滤法取 10 - 20 mL，直接接种法取 2 - 5 mL，保证与样品的检测条件完全匹配。

3、阴性对照的制备与标记

在百级生物安全柜内，用无菌移液管吸取定量替代物，按样品检测的完整流程处理：薄膜过滤法需同步完成过滤、冲洗(3 - 5 次，每次 10 - 20 mL);直接接种法需直接注入 TSA/SDA 培养基并混匀。

清晰标注对照信息，标签包含 “阴性对照 + 检测方法 + 样品批次 + 日期 + 操作者”，例如 “阴性对照 - 薄膜过滤 - 培养液批次 2025001 - XXX”，避免与样品、阳性 / 空白对照混淆。

数量设置与培养安排

每批次检测至少设置 1 份阴性对照，若检测样品含抗生素等抑菌成分，可增加至 2 份，确保覆盖不同检测环节的污染风险。

阴性对照需与样品、阳性对照、空白对照同步放入同一培养箱，遵循相同培养条件：TSA/TSB 培养基 30 - 35℃培养 14 天，SDA 培养基 20 - 25℃培养 14 天，不可更改温度、时间或单独培养。

4、阴性对照设置的关键规范

操作完全同步，无步骤差异

从耗材使用(同批次滤膜、培养瓶)、冲洗次数、接种方式到培养条件，阴性对照需与检测样品 1:1 复刻，不可简化步骤(如少冲洗 1 次)或更换耗材，否则无法准确排除外源性污染。

分区操作，避免交叉污染

在生物安全柜内划分专属操作区域，优先处理阴性对照、空白对照和样品，最后处理阳性对照。阴性对照使用的移液管、滤杯等耗材需独立灭菌，不可与阳性对照共用。

避免替代物二次污染

替代物开封、取样时，瓶口需用 75% 酒精擦拭 2 次，待酒精完全挥发后再操作;取样后立即密封替代物容器，剩余液体按无菌要求存放或废弃。

5、阴性对照的有效性判定标准

培养 14 天后，阴性对照需满足培养基澄清无浑浊、无菌落 / 菌丝生长、无沉淀，即为合格。若出现异常，需按以下方式处理：

若阴性对照污染，立即停止本次检测，排查污染源头(生物安全柜未消毒、耗材灭菌不彻底、替代物带菌等)，整改后更换所有耗材和试剂，重新制备对照及样品并检测。

若阴性对照合格，样品检测结果异常(如出现微生物生长)，可排除外源性污染，聚焦样品本身的污染问题。