不同种类的生物试剂，在进行功能验证时有哪些注意事项?

不同种类的生物试剂，在进行功能验证时有哪些注意事项?

这是一个非常专业的问题。不同生物试剂的功能验证方法差异很大，但确实存在一些共通的注意事项和特定的考量点。

总的原则是：为你的目标应用（Application）进行验证，并设置严谨的对照。

以下是几类常见生物试剂在功能验证时的核心注意事项：

1. 抗体 (Antibody)

抗体的验证是出了名的复杂，因为它的成功高度依赖于应用场景。

金标准：正交验证

最佳实践：同时使用两种或以上针对不同表位的抗体进行检测。如果结果一致，则特异性更高。

基因层面验证：通过 siRNA/CRISPR 敲低 / 敲除目标基因，然后用该抗体检测。如果信号显著下降，则是特异性强的有力证据。

应用特异性：

WB (Western Blot)：关注主条带大小是否正确，杂带是否过多。

IHC/IF (免疫组化 / 荧光)：关注信号定位是否符合预期(如细胞核、细胞质)，阴性对照(不加一抗或用无关抗体)应无信号。

关键对照：

阳性对照：已知表达该蛋白的细胞或组织。

阴性对照：已知不表达该蛋白的细胞或组织，或使用无关的同型对照抗体。

2. 酶 (Enzymes)

酶的活性是其唯一生命线，验证的核心是活性单位。

严格遵循标准方案：使用供应商推荐的、经过优化的反应条件(温度、pH、缓冲液)进行测试。

使用定量标准品：

例如 (PCR)：使用已知浓度的标准品 DNA，绘制标准曲线，评估酶的扩增效率和灵敏度。

例如 (限制性内切酶)：使用推荐的底物 DNA，在规定时间内检查消化是否完全。

警惕抑制物：确保反应体系中没有来自模板或缓冲液的抑制物。

3. qPCR 试剂盒

qPCR 验证的目标是效率、灵敏度、重复性。

标准曲线是必须的：

使用梯度稀释的、高质量的标准品(如质粒 DNA 或 cDNA)。

评估指标：

效率 (Efficiency)：应在 90%-110% 之间 (斜率 ≈ -3.3 to -3.6)。

相关系数 (R²)：应 > 0.99.

熔解曲线分析：

确保扩增产物是单一的、特异性的峰，没有非特异性扩增或引物二聚体的峰。

重复性测试：对同一样品进行多次重复(至少 3 次技术重复)，检查 Ct 值的标准差是否很小(通常 < 0.3)。

4. 细胞培养基与添加剂

这类试剂的验证重点是能否维持细胞的正常生理状态。

使用 “哨兵” 细胞系：选择一种生长特性明确、对培养条件敏感的细胞系(如 HEK293. HeLa)进行测试。

监测细胞状态：

生长曲线：绘制细胞生长曲线，与使用已知良好培养基的对照组比较，看倍增时间是否一致。

形态观察：在显微镜下观察细胞形态是否正常，有无分化或凋亡迹象。

功能指标：如果条件允许，可以检测一个对培养环境敏感的细胞功能(如特定蛋白的表达)。

无菌性检查：在使用前，将培养基放置在培养箱中培养 24-48 小时，确认无细菌或真菌污染。

通用注意事项总结

永远使用新鲜的、高质量的对照品：对照品的质量是验证结果可信的基础。

记录一切：详细记录试剂批次号、验证日期、所有实验参数和结果。

遵循 SOP：建立并严格遵守标准操作程序 (SOP)，确保每次验证的条件都一致。